СМЕШАННЫЕ ИНФЕКЦИИ: скрытые тайны вирусов (часть 2)
Валерия Рябинина, Кирилл Плотников (научно-исследовательский сектор НИЦ «Инновации»)
Вот мы и добрались до статьи, завершающей трилогию о вирусах, в которой углубимся в механизмы, лежащие в основе синергетических/антагонистических взаимодействий, влияния на хозяев и переносчиков. И расскажем о современных способах диагностики смешанных инфекций. Готовьтесь узнать еще больше сложных слов. Поехали!
СИНЕРГИЗМ
Вспоминаем, что синергизм между вирусами может проявляться в усилении репликации одного или обоих вирусов, приобретении способности вторгаться в новые ткани растений и зависимости одного вируса от другого для передачи или других важных функций.
Типы и причины синергических взаимодействий
Хелперная зависимость возникает, когда один из вирусов, участвующих в смешанной инфекции, не имеет необходимых функций для переноса или размножения (зависимый вирус) и ему требуется вирус-хелпер (от англ. help – помощь). При такого рода взаимодействии симптомы, вызванные вирусом-помощником, либо ослабевают, либо усугубляются. Это естественный способ поддержания смешанных инфекций в случае умбравирусов, которым не хватает генетической информации для кодирования белка оболочки, поэтому они зависят от лютеовирусов для инкапсидации и дальнейшего распространения тлями.
Также вироид веретеновидности клубней картофеля (PSTVd) передается тлей только после его маскировки в капсиде вируса скручивания листьев картофеля (PLRV), без этого – механически.
Гетерологичная комплементация/транскомплементация – это еще одна форма содействия, при которой неструктурные белки, называемые хелперными компонентами, действуют как мосты между вирусными частицами, облегчая их передачу. Так, потивирусы имеют белок HC-Pro, который связывается с кутикулярной выстилкой рта тли. Имея эту связь, он может образовывать мосты с другим вирусом, который приобретает способность распространяться вредителем. Такая способность к передаче сохраняется даже если тля ранее питалась зараженным потивирусом растением.
Расширение тканевого тропизма. Тканевой тропизм обусловлен специфичностью патогена – способностью поражать только некоторые типы клеток или тканей. При смешанных инфекциях вирусы приобретают способность заражать другие ткани растений, особенно те из них, которые ограничены флоэмой. Расширение тканевого тропизма неродственных вирусов происходит: а) с помощью белков движения одного вируса для преодоления дефицита движения другого; б) с вирусными белками-супрессорами, подавляющими защитные механизмы растения.
Например, у растений N. benthamiana при единичных инфекциях вирус желтой пятнистости томатов (ToYSV) локализуется в клетках мезофилла, а вирус морщинистой мозаики томата (ToRMV) – во флоэме. Но при коинфекции ToRMV приобретает способность проникать из флоэмы в клетки мезофилла (рис. 1).
Рис.1. Флуоресцентная микроскопия полутонких срезов мезофилла после гибридизации с вирусспецифичными зондами к ToRMV и ToYSV у единично и смешанно инфицированных растений
Изменение диапазона хозяев – это ситуация, при которой растение, зараженное одним вирусом, становится восприимчивым к заражению другими вирусами, которые не способны заразить его при единичных инфекциях. Это может происходить, когда геном одного патогена маскируется в оболочке другого. Вирус пятнистости листьев салата (LSMV), упаковываясь в капсидный белок вируса западной желтизны свеклы (BWYV), получает возможность распространяться тлей на другие растения, в том числе и свеклу.
АНТАГОНИЗМ
Антагонизм в основном обусловлен активацией защитных реакций хозяина при заражении первичным вирусом, что предотвращает последующее заражение вторичным. Снижение скорости размножения вирусов может быть связано с жесткой конкуренцией за ресурсы хозяина при смешанных инфекциях, что приводит к снижению заболеваемости в отличие от единичных.
Типы антагонистических взаимодействий
Низкий синергизм + высокий антагонизм. Во многих случаях смешанных инфекций наблюдается низкий синергизм и высокий антагонизм. У томатов, инфицированных вирусом томата торрадо (ToTV) и вирусом мозаики пепино (PepMV), есть небольшое увеличение титров ToTV на ранних стадиях инфекции, что указывает на синергизм, а титры PepMV постоянно сильно уменьшены, что свидетельствует об антагонизме.
Гомологичное вмешательство/исключение суперинфекции, чаще называемое перекрестной защитой, при которой присутствие одного вируса в клетке препятствует заражению другим вирусом, что способствует защите хозяина путем исключения суперинфицирующего агента. Это происходит, даже если основной вирус слабее последующего, что связано с максимальным продуцированием частиц – потомков первого вируса после заражения клетки. Такой тип антагонистических взаимодействий характерен для близкородственных вирусов и вирусных штаммов.
ВОЗДЕЙСТВИЕ НА РАСТЕНИЕ-ХОЗЯИНА
Модификация хозяина/измененная экспрессия генов
Воздействие на растение-хозяина заключается в усилении работы его генов и физиологических модификациях. При смешанных инфекциях изменений в метаболизме растения происходит больше, чем при вызванных единичными вирусными инфекциями.
При сопутствующих инфекциях вирусов картофеля Х и Y (PVX-PVY) относительная доля измененных генов была намного больше, чем при единичных заболеваниях PVХ и PVY. Патогены подавляют экспрессию генов, отвечающих за функции хлоропласта, и берут под контроль экспрессию генов, отвечающих за метаболизм, синтез и деградацию белка, а также реакцию на биотические стимулы и стресс. Повышенное перекисное окисление липидов и образование супероксидных радикалов в хлоропластах – свидетельство сильного окислительного стресса в листьях.
Пути глушения РНК/посттранскрипционного глушения генов (PTGS)
Представляют собой механизм, который используется растениями для предотвращения заражения патогенами посредством таких процессов, как модификация хроматина, метилирование ДНК и активность малых РНК (siRNAs). Когда происходит атака нескольких синергетических вирусов, растения энергично реагируют повышением уровня siRNAs, чтобы активировать PTGS против вторгающихся вирусов.
Обрыв сопротивления
Когда у растения нарушается устойчивость к заражению каким-либо вирусом, оно превращается из не-хозяина в хозяина. Так, проникновение одного вируса в растение может способствовать нарушению его резистентности к другому вирусу, что будет приводить к смешанным инфекциям и расширению круга хозяев.
Это наблюдалось у растений томатов к вирусу пятнистого увядания томатов (TSWV), коинфицированных вирусом хлороза томатов (ToCV), и у растений огурца к вирусу мозаики огурца (CMV), коинфицированных вирусом желтой мозаики цукини (ZYMV). Потеря резистентности может не зависеть от порядка инфицирования вирусами, как в случае CMV и ZYMV. В то время как восприимчивость устойчивых томатов к TSWV возникала только после предварительной инокуляции ToCV, но при одновременном попадании вирусов в растение такого эффекта не наблюдалось.
ПЕРЕНОСЧИКИ
Изменения, вызванные вирусами при заражении растений, влияют на поведение и физиологию переносчиков.
Различают прямое векторное манипулирование – это управление переносчиками таким образом, чтобы их привлекали зараженные растения для приобретения вируса и здоровые – для передачи за счет изменения физиологических функций самих насекомых. Так, безвирусных вредителей привлекают зараженные растения, а после питания – безвирусные или зараженные другим вирусом. Например, вирус желтой курчавости листьев томата (TYLCV) вызывает апоптотическую дегенерацию нейронов головного мозга своего переносчика – табачной белокрылки (рис. 2).
Рис. 2. Конфокальные изображения срезов головного мозга белокрылки при искусственном питании с вирионами TYLCV или без них
Косвенное манипулирование переносчиком через хозяина происходит, когда вирусы увеличивают привлекательность растения для насекомых за счет изменения визуальных, обонятельных или вкусовых признаков. Коинфекция PVY и PLRV повышала привлекательность растений картофеля для питания и размножения тли из-за увеличения содержания сахаров и аминокислот во флоэме. Замечено, что растения, зараженные несколькими вирусами, больше привлекают переносчиков для питания, чем единично зараженные.
ОБНАРУЖЕНИЕ И ДИАГНОСТИКА СМЕШАННЫХ ИНФЕКЦИЙ
Биологический анализ
Биологическое индексирование представляет собой подход к выявлению инфекции, основанный на способности патогена вызывать симптомы при механической инокуляции (прививке) на определенных растениях-индикаторах. Его можно эффективно использовать для выявления заражения растений единичными вирусами. Однако смешанные вирусные инфекции изменяют симптомы. Был выявлен ряд индикаторных растений, очень восприимчивых к заражению многими вирусными и вирусоподобными заболеваниями, которые могут быть использованы для выявления широкого спектра патогенов.
Применение растений-индикаторов позволяет изучать накопление и соотношение вирусов в организме, вероятность проявления симптомов при смешанных инфекциях. Однако вариабельность симптомов может зависеть и от самого растения-индикатора. При изучении смешанной инфекции PVX и PVY внешние повреждения, характерные для PVX, появлялись на Gomphrena globosa L., а для PVY – на Chenopodium amaranticolor, в то время как тяжелая мозаика наблюдалась для обоих вирусов на Nicotiana tabacum cv. White burley.
Однако сравнение результатов биологических анализов с результатами серологических или молекулярных тестов показало ограничения в обнаружении и идентификации многих патогенов.
Иммуноанализы
Иммуноанализы, также называемые серологическими, зависят от специфических взаимодействий антиген – антитело. При этом антитела конструируются против специфических белков вируса, взаимодействие которых указывает на положительное присутствие вируса в образце.
Коктейльный иммуноферментный анализ
ИФА является широко распространенным методом и используется в основном для обнаружения единичных вирусов из-за специфической реакции антитело – антиген против одного целевого патогена. Тем не менее проводились исследования по изготовлению коктейльных антител для одновременного выявления нескольких вирусных инфекций.
Положительный результат ИФА виден как проявление цвета (рис. 3), но дифференцировать разные вирусы в коктейльном анализе сложно, если для них не предусмотрены различные цвета. Так, в эксперименте по созданию теста для одновременного обнаружения PVX и PVY можно было определить наличие смешанной инфекции. При этом одна цветовая реакция не позволяла определить наличие инфекций по отдельности. Использование коктейльных тестов очень полезно для учета безвирусного материала, особенно в культурах, размножаемых вегетативно.
Рис. 3. Изменение цвета раствора в лунках при положительной реакции в ИФА
Массив антител представляет собой привлекательную технологию, где антитела прикрепляются на твердой подложке и захватывают целевые образцы для реакции антиген – антитело, результаты которой могут быть обнаружены также по изменению или появлению цвета. Китайскими учеными была разработана визуальная матрица антител на нитроцеллюлозной мембране (рис. 4) для одновременного и быстрого обнаружения десяти патогенов, инфицирующих пасленовые, то есть Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, CMV, PepMV, TSWV, вирус аспермии томатов (TAV), вирус томатной мозаики (ToMV), вирус черных колец томатов (TBRV), вирус табачных пятен (TRSV), вирус кольцевых пятен томатов (ToRSV) и вирус табачной трещотки (TRV), которая по точности результатов сопоставима с ИФА.
Рис. 4. Массив антител на 10 инфекций: наличие точек обозначает положительную реакцию
Иммунохроматографический анализ представляет собой быструю и дешевую процедуру одновременного выявления нескольких патогенов на местах. Обычно это полоски, изготовленные из нитроцеллюлозной мембраны, пропитанной антителами на тестовой линии, где происходит антиген-положительная реакция. Так, разработаны полоски для мультиплексного определения вирусов картофеля (PVY, PVX, PVA, PVM, PVS, PLRV) вместе с бактерией (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus).
Методы на основе нуклеиновых кислот
Использование нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) непосредственно для обнаружения вирусов в растении-хозяине является распространенным способом диагностики из-за чувствительности, специфичности и быстроты наряду с экономической эффективностью. Праймеры и зонды разрабатывают против определенной области или всего генома конкретного вируса, которые затем используются для создания множества копий того же фрагмента (амплификации), чтобы его можно было детектировать.
НИЦ «Инновации» отдает предпочтение этим методам исследования, так как они подходят для рутинной диагностики фитопатогенов и дают простор для научных изысканий.
Мультиплексная полимеразная цепная реакция (mPCR) и мультиплексная ПЦР с обратной транскрипцией (mRT – PCR) – наиболее часто используемые методы для рутинной диагностики смешанной инфекции в посевах. Однако одновременное обнаружение вирусов в одной пробирке ограничено тем, что для каждой мишени должна использоваться своя пара праймеров. Но чем больше количество пар праймеров, тем больше вероятность неспецифической реакции. Поэтому создание таких тест-систем требует скрупулезной работы и профессионализма авторов.
ПЦР в реальном времени/количественная ПЦР (qPCR) позволяет осуществлять мониторинг и определять абсолютное количество мишеней. Метод может быть легко адаптирован для обнаружения 2–5 вирусов. Его польза для изучения смешанных инфекций заключается в одновременном количественном определении вирусной нагрузки каждого соответствующего вируса в образце (рис. 5). Так, ученые НИЦ «Инновации» изучали накопление вирусной нагрузки вируса зеленой крапчатой мозаики огурца (CGMMV).
Рис. 5. График количественного определения вирусов в образце методом ПЦР в реальном времени
Секвенирование нового поколения (NGS) – это высокочувствительный подход, обладающий потенциалом для поиска полного спектра вирусов и вирусоподобных агентов в одном образце, включая известные и неизвестные. Благодаря этому методу происходит поиск и открытие новых вирусов.
Помимо способности обнаруживать и идентифицировать вирусы различных семейств и родов, с помощью NGS можно определять сопутствующие инфекции нескольких изолятов или вариантов вируса. Это важно, так как их влияние на симптомы заболевания и взаимодействие сильнее, чем между вирусами, принадлежащими к разным семействам.
NGS редко используют в рутинной диагностике из-за его относительно высокой стоимости и временных затрат, необходимых для анализа огромного массива полученных данных.
THE END
Различные случаи взаимодействия вируса с вирусом, которые мы рассмотрели, не вписываются в дихотомическое разделение синергизма или антагонизма. Взаимодействия между родственными и неродственными вирусами, их хозяевами и переносчиками динамичны, специфичны и дают непредсказуемые результаты. Мир вирусов растений до сих пор не изучен до конца и полон загадок. Ученые НИЦ «Инновации» вносят свой вклад в его изучение. Нами разработан и запатентован эффективный способ борьбы с вирусами овощных культур. Но об этом мы расскажем в другой раз. Следите за публикациями.
