Валерия Рябинина (лаборатория «ФИТОДИАГНОСТИКА»)

В последнее время тепличное сообщество взволновано угрозой появления опасного для томатов патогена – Pseudomonas mediterranea. Что это за бактерия и стоит ли паниковать – попробуем разобраться в этой статье. 

Pseudomonas mediterranea (Pmed) – это бактерия, относящаяся к нефлуоресцирующим псевдомонадам, вызывающим некроз сердцевины – заболевание томатов, приводящее к серьезным потерям урожая (от 5 до 100%). 

Бактериальный некроз сердцевины поражает растения томата, перца, хризантем на любой стадии развития и в различных системах выращивания (теплица, поле или гидропоника). Заболевание было впервые описано в Великобритании на тепличных томатах в 1970 году Скарлеттом, а возбудитель, вызывающий это заболевание, изначально был идентифицирован как бактерия Pseudomonas corrugata (Pcor). В 2002 году филогенетический анализ показал, что в P.corrugata присутствуют два близкородственных, но различных таксона, и эти отличающиеся по геному штаммы были отнесены к новому виду – P.mediterranea.

Как следует из названия mediterranea (средиземноморский), большинство штаммов этого вида были обнаружены в странах Средиземноморья. Первоначально бактерия выделена из зараженных растений с некрозом сердцевины в Италии, Франции и Испании, а затем в Португалии, Турции, Бразилии, Саудовской Аравии и Аргентине.

СИМПТОМЫ

Начальные симптомы заболевания заметны в виде увядания нижних ветвей, на которых листья медленно теряют тургор и хлорофилл. По мере развития болезни листья на пораженных ветках засыхают и загибаются внутрь, начиная от края к середине листа (рис. 1). 

Рис. 1. Первые признаки заболевания – скручивание листьев

Далее начинают высыхать сами ветви, сухие листья не опадают. Постепенно увядание распространяется вверх. Плодоношение пораженных растений протекает нормально, на плодах не наблюдается никаких симптомов (рис. 2).

Рис. 2. Засыхание веток

При более позднем развитии болезни на стебле появляются коричневые пятна и трещины, через которые можно видеть некротизированную внутреннюю часть. (рис. 3). Также стебель может быть утолщен и мягок на ощупь. Иногда на листовом рубце можно заметить следы бактериального экссудата. Часто наблюдается появление придаточных корней. При поперечном разрезе сердцевина может выглядеть как: некротическая, сухая и слегка раздробленная; гидропическая, белая или темная, но имеющая твердую сердцевину и некротизированная в областях около ксилемы; раздробленная из-за образования лестничных полостей. Некроз может также поражать стержневой корень и, иногда, корешковые отростки.

Рис. 3. Некроз сердцевины стебля

Распространяясь, некроз со стороны стебля поражает и ветви. Плоды, которые к этому времени нормально развились, начинают отставать в росте, не могут дозреть до конца, имеют желто-красную окраску (рис. 4). Симптомы поражения плодов вторичны и возникают в результате того, что внутренняя часть растения омертвела, нарушена функция проводящих сосудов и они не могут транспортировать питательные вещества к плоду, из-за чего те отстают в росте и теряют в качестве. 

Рис. 4. Изменения плодов

Эти симптомы могут проявляться в большей или меньшей степени в зависимости от срока заражения и погодных условий. Влажная погода и низкие температуры благоприятствуют развитию болезни. Если температура высокая,  относительная влажность воздуха низкая, а заражение произошло на более поздних стадиях развития, растения восстанавливаются и нормально плодоносят. Чем моложе растение, тем быстрее и сильнее проявляются симптомы, вплоть до полного отмирания. Корневая система у пораженных растений развивается нормально и не проявляет никаких признаков заболевания.

На перцах и хризантемах симптомы аналогичны вышеописанным. Зараженные растения демонстрируют хлороз, увядание листьев и обширный некроз сердцевины. В отличие от зараженных растений томата, воздушные корни не образуются.

ПАТОГЕНЕЗ

P.mediterranea способна колонизировать ризосферу томата и начинать эндофитную колонизацию с инокулята, присутствующего в субстрате, а также с зараженных семян. Бактерия проникает в хозяина через раны на стебле, корневой шейки и корнях. При попадании в паренхимные ткани растений P.mediterranea и P.corrugata встраиваются в поверхность клеточной стенки (рис. 5). 

Рис. 5. Микрофотографии, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа, из сердцевины стеблей томатов, инокулированных Pseudomonas corrugata. A – отдельные бактериальные клетки, некоторые из них делятся в межклеточном пространстве сердцевины через 4 часа после инокуляции. B – нити фибриллярного материала поддерживают бактериальный контакт через 12 часов после инокуляции. Многослойное расположение клеток, постепенно внедряющихся в матрикс внеклеточного полисахарида, в период между 24 (C) и 96 часами (D) после инокуляции

Граница инфекции находится на расстоянии от 3 до 6 см от края видимых симптомов, где концентрация бактерий около 10⁵ КОЕ/г в бессимптомной ткани и на два-три порядка выше в симптоматической. Колонизация стебля также может распространяться по направлению к ксилеме и эпидермису, откуда бактерия выходит в виде бактериального экссудата в условиях высокой влажности.

Так как P.mediterranea не является сосудистым патогеном, предполагается, что заражение семян происходит за счет процесса интернализации, при котором бактериальные клетки достигают внутренних тканей плодов через естественные отверстия на ранних стадиях развития плодов. Попадание бактерий на полностью раскрывшиеся цветки приводит к заражению семян (2×10³ КОЕ/г семян), а при попадании на незрелые зеленые плоды патоген в семенах в дальнейшем не обнаруживается. 

ПУТИ ПЕРЕДАЧИ

Бактерия может передаваться через семена, но частота их заражения неизвестна. В условиях теплиц фитопатоген из зараженных растений может распространяться брызгами от разбрызгивателей, а также во время уходовых работ. Он способен попадать из корней в циркулирующий питательный раствор поливной системы и, таким образом, заражать здоровые растения. Поливная вода может играть роль в распространении патогена.

Наличие свободной воды на поверхности листьев и стеблей (из-за ограниченного притока воздуха, чрезмерного полива или резкой разницы дневных и ночных температур) и высокое содержание азота в субстрате способствуют заражению P.mediterranea.

ВИРУЛЕНТНОСТЬ

На данный момент нет коммерческих сортов томата с доказанной устойчивостью к патогенным бактериям, вызывающим некроз сердцевины. Степень тяжести поражения, вызванного P.corrugata и P.mediterranea, в равной степени зависит от восприимчивости гибрида и штамма бактерии. 

Механизмы вирулентности обоих видов псевдомонад схожи и определяются чувством кворума (Quorum Sensing, QS), которое кодируется системой генов. P.mediterranea содержит систему PmeI/R, которая является высоко гомологичной системе PcoI/R у P.corrugata. Выработка циклических полипептидов (CLP), регулируемая этими генами, напрямую влияет на заражение и развитие симптомов некроза у томатов. Показано, что инактивация генов QS снижает вирулентность у обеих бактерий.

Чувство кворума – это способность популяции бактерий координировать свою деятельность в зависимости от плотности клеток, основано на выработке сигнальных молекул и реакции на них. 

 ДИАГНОСТИКА

P.mediterranea имеет те же общие характеристики, что и P.corrugata. Это грамотрицательная палочка, не образующая спор. Обе бактерии легко изолируются от инфицированных растений на бактериологических агаризованных средах. На питательном агаре с добавлением 1% глюкозы формируют морщинистые или гладкие колонии (рис. 6). Часто продуцируют желтовато-коричневые пигменты. Бактерии подвижны благодаря множественным полярным жгутикам. P.mediterranea является строгим аэробом и не флуоресцирует на среде Кинга B. 

Рис. 6. Фенотипы штаммов Pseudomonas corrugata и P.mediterranea: A – шероховатая морфология колоний с продукцией желтого диффузного пигмента в среде и реакция гиперчувствительности (HR) у Nicotiana benthamiana, B – гладкие колонии, не продуцирующие пигмент, не вызывающие HR

Внутривидовая изменчивость и появление мутантов требуют большой осторожности при использовании автоматизированных систем идентификации, которые основаны на профилях питания или газохроматографическом анализе МЭЖК. Более того, P.mediterranea и другие филогенетически родственные Pseudomonas могут отсутствовать в некоторых базах данных. Можно использовать автоматические системы идентификации, основанные на профилях жирных кислот в клетках или использовании источников углерода. P.mediterraneа отличается от P.corrugata в усвоении мезотартрата, 2-кетоглюконата и гистамина в качестве, вероятно, единственного источника углерода и азота.

Большинства проблем в идентификации возбудителей болезни можно избежать, используя методы на основе ДНК, например полимеразную цепную реакцию с видоспецифическими праймерами. В лаборатории «ФИТОДИАГНОСТИКА» разработаны тест-системы для идентификации бактерий видов P.mediterranea и  P.corrugata. Это позволяет точно разделить близкородственные бактерии и избежать перекрестной реакции с другими бактериальными патогенами рода Pseudomonas. 

ЗАЩИТА РАСТЕНИЙ 

Борьба с некрозом сердцевины томатов сопряжена с трудностями доставки антибиотиков в очаги патогена, поскольку возбудитель находится во внутренних тканях растения. Поэтому вылечить зараженные растения невозможно. На первое место выходит сочетание профилактических мер и стратегий биоконтроля. 

Профилактические меры:

1. Здоровые семена, по возможности проверенные на наличие P. mediterraneа.
2. Санитарная обработка и тщательное удаление растительных остатков из теплицы, как источника инфекции. 
3. Севооборот – чередуйте культуры, чтобы избежать накопления патогенов.
4. Оптимизированные условия выращивания – избегайте условий, способствующих развитию болезней, таких как избыточная влажность, низкие температуры и высокая плотность посадки растений.
5. Избыточный полив может способствовать распространению бактерий.
6. Выбор гибрида – лучше отбирать томаты с определенной степенью толерантности.
7. Раннее выявление – регулярно осматривайте растения на наличие признаков инфекции. 

В качестве агента биоконтроля можно использовать Pseudomonas fluorescens, как для замачивания семян перед посадкой, так и для внекорневых обработок и при поливе. 

ДЕЗИНФЕКЦИЯ

P.corrugata и P.mediterranea производят множество биомолекул, которые играют важную роль в выживании бактериальных клеток. Оба вида продуцируют различные среднецепочечные полигидроксильные кислоты (mcl-PHA), которые формируют прозрачную пленку у P.mediterranea и липкий эластомер у P.corrugata. Поэтому стратегия дезинфекции должна быть направлена на первостепенное разрушение биопленки и использование наиболее эффективных средств. 

Для псевдомонад характерна довольно быстрая выработка резистентности к антибиотикам и дезинфицирующим средствам. Существует несколько причин распространенности резистентности к дезсредствам: неправильная концентрация, неправильное использование и недостаточная подготовка к применению дезинфицирующих средств. Изоляты с сильным и умеренным образованием биопленок нуждаются в более высокой концентрации дезинфицирующего средства для обеззараживания. Ряд исследований показал преимущества гипохлорита натрия для борьбы с псевдомонадами перед другими дезсредствами, например четвертичными аммонийными соединениями. Так, 5% гипохлорит демонстрирует высокую, а 70% этанол низкую бактерицидную активность.

Для повышения эффективности дезинфицирующего средства за счет создания синергетического эффекта против изолятов Pseudomonas можно использовать альтернативные соединения, такие как ЭДТА, в сочетании с дезинфицирующим средством. Добавление в раствор ЭДТА усиливает бактерицидный эффект. В медицине он одобрен в качестве противомикробного средства для снижения риска образования бактериальной биопленки и ее колонизации. ЭДТА известен как хелатирующий агент двухвалентных металлов и разрушает внешний липополисахаридный слой грамотрицательных бактерий, что делает мембрану патогенных бактерий более проницаемой для дезинфицирующих агентов. ЭДТА полностью поддается биологическому разложению и не оказывает токсического воздействия на человека. 

БАКТЕРИИ ПРОТИВ ГРИБОВ

Было продемонстрировано потенциальное применение некоторых из продуцируемых псевдомонадами молекул для биологического контроля фитопатогенных бактерий и грибов. P.mediterranea и P.corrugata в культуре продуцируют диффузионные соединения, которые способны ингибировать in vitro фитопатогенные грибы: Aspergillus niger, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Penicillum digitatum, Phoma tracheiphila, снижая их рост на 35–56%.

Также оба вида продуцируют антимикробные, фитотоксичные поверхностно-активные циклические липопептиды (CLPs), такие как корпептины и кормицин, липопептидный  сидерофор, корругатин. CLP создают поры путем прямого взаимодействия с липидами в клеточной мембране, изменяют электрический потенциал, вызывая гибель клеток. Их антимикробная активность в отношении грамположительной бактерии C.michiganensis subsp. michiganensis выше, чем в отношении грамотрицательной P.syringae pv. tomato. Также ингибируется рост грамположительной бактерии Bacillus megaterium и дрожжей Rhodotorula pilimanae in vitro (рис. 7).

Рис.7. Антибактериальная активность P.mediterranea

Широко распространенным свойством псевдомонад является производство летучих веществ, в частности цианистого водорода (HCN). Эксперименты in vitro на фитопатогенном грибе Botrytis cinerea показали, что выработка HCN в основном связана с ингибированием прорастания конидий.

Таким образом, P.mediterranea и P.corrugata обладают высоким потенциалом для производства ценных микробных продуктов при биотехнологической эксплуатации. Их метаболиты, включая антибиотики, ферменты и летучие вещества, являются ключевыми факторами подавления патогенов растений и могут сыграть важную роль в качестве средств защиты или биопестицидных активных веществ. 

РЕЗЮМЕ

Исходя из вышесказанного, P.mediterranea ничуть не страшнее давно знакомой P.corrugata. И степень поражения томатов будет зависеть от восприимчивости гибрида, штамма бактерий и условий внешней среды. При неблагоприятном сочетании этих факторов потери урожая могут составить до 70–80%. Зато вряд ли стоит ожидать смешанных инфекций с патогенными грибами и клавибактериозом. 

Вылечить зараженные бактериями растения невозможно, поэтому лучше не допускать заноса инфекции на комбинат. Для исследования семян или при обнаружении признаков некроза сердцевины на растениях направляйте материал для исследования в лабораторию «ФИТОДИАГНОСТИКА», где могут быстро и точно определить и дифференцировать бактерии P.mediterranea и P.corrugata.

Контакт для отправки материала: ООО «ФИТОДИАГНОСТИКА», г. Новосибирск, ул. Добролюбова, д. 154/1, кв. 1, тел. 8 (923)222-14-04.