Валерия Рябинина (НИЦ «Инновации»)
Бактериальный рак считается одним из наиболее разрушительных заболеваний томатов и вызывается передаваемой из семян грамположительной бактерией Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis. Этот сосудистый патоген обычно проникает и размножается в ксилеме через естественные отверстия или раны, вызывая массовое увядание растений.
Бактериальный рак томатов, вызываемый Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis (Cmm), – это серьезная угроза для производства томатов. Преждевременная гибель растений, зараженных Cmm, наносит существенный экономический ущерб. Полевые эксперименты фиксировали потери урожая до 84% на коммерческих полях в Канаде, 20–30% во Франции и 46% в Иллинойсе (США). Хотя появление этого заболевания носит спорадический характер и потери, вызванные вспышками, также могут быть незначительными.
Clavibacter michiganensis – неподвижный грамположительный актиномицет, единственный признанный вид рода Clavibacter. Существует несколько подвидов, которые вызывают разрушительные заболевания сельскохозяйственных культур (таблица 1). Три из них, включая Cmm, в ряде стран классифицируются Европейской и Средиземноморской организацией по защите растений (ЕОКЗР) как карантинные объекты.
Актиномицеты (устар. – лучистые грибки) образуют в пораженных тканях клубок плотно переплетающихся нитей с отходящими от центра лучами.
Таблица 1. Подвиды Clavibacter michiganensis и их растения-хозяева
| Подвид | Симптом | Хозяин |
| californiensis | Бессимптомный | Томат |
| capsici | Бактериальный рак | Болгарский перец, сладкий перец |
| chilensis | Бессимптомный | Томат |
| insidiosus* | Увядание и задержка роста | Люцерна |
| michiganensis* | Бактериальное увядание и рак | Томат |
| nebraskensis | Увядание и отравление | Кукуруза |
| phaseoli | Пожелтение листьев | Фасоль обыкновенная |
| sepedonicus* | Кольцевая гниль | Картофель |
| tessellarius | Крапчатость и пятнистость листьев | Пшеница |
*Карантинные объекты
ПЕРЕДАЧА Cmm
Зараженные семена являются причиной распространения Cmm во всем мире. И делают возможным перенос возбудителя в ранее свободные от бактериального рака регионы. Заражение семян происходит, когда Cmm проникает в семенную оболочку и эндосперм через сосудистую систему больного материнского растения. Причиной системных инфекций также могут служить семена, зараженные Cmm в результате контакта с другими источниками бактерий.
Загрязненная почва и остатки растений долго являются резервуарами возбудителя. В естественных полевых условиях Cmm может сохраняться в растительных остатках более 10 месяцев и способствовать почвенным инфекциям на срок до 4 лет.
Cmm проникает в листья, стебли и корни через раны или естественные отверстия (рис. 1), включая устьица и гидатоды, позволяя болезни распространяться в боковом направлении через брызги или капающую воду, и через загрязненные инструменты.
К скрытому распространению болезни приводит то, что подвиды C.michiganensis, которые являются патогенным для конкретного растения-хозяина, могут эндофитно колонизировать растения, не являющиеся хозяевами.
Эндофиты – микроорганизмы, которые живут внутри растения и не вызывают каких-либо негативных последствий для его функционирования.
Рис. 1. Схема развития бактериального рака в стебле томата после заражения Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis (Cmm)
СИМПТОМЫ
Растения, инфицированные Cmm, проявляют симптомы (рис. 2) в зависимости от возраста растения-хозяина, восприимчивости сорта и вирулентности бактерии, а также определенных условий окружающей среды, включая температуру и влажность. Когда растения заражаются на ранних стадиях их жизни (семена или молодые проростки), развиваются системные инфекции (также называемые первичными), которые влияют на качество плодов и урожайность и обычно приводят к гибели. У старых растений часто развиваются внекорневые инфекции (вторичные), которые вызывают хлороз листьев, но могут влиять, а могут и не влиять на качество и количество текущего урожая.
Во время системной инфекции болезнь может вначале протекать бессимптомно. Первые признаки появляются через 6– 8 недель, когда титр бактерий достигнет 109–1010 на грамм растительной ткани. После проникновения Cmm размножается в сосудах ксилемы, вызывая потемнение внутренней сосудистой сети с постепенной деградацией сосудистых тканей. Это нарушает водный транспорт и приводит к увяданию на начальных этапах заболевания, которое поднимается снизу вверх.
Растения томатов, инфицированные на поздних стадиях вегетации, могут болеть бессимптомно или увядать медленно. Они способны давать товарные плоды, но являются эффективным источником инфекции в течение следующего оборота.
Рис. 2. Симптомы бактериального рака у томата: А – проявление на листьях; Б – на плодах усиливается сосудистый рисунок; В – увядание растений; Г – терминальная стадия инфекции
ПРИЧИНА В ГЕНАХ
Степень выраженности симптомов и тяжесть течения болезни зависят от того, какие гены имеет конкретный штамм Cmm и какие из них включаются в процесс заражения. Так, патогенные штаммы Cmm отличаются от эндофитных наличием плазмид pCM1 и pCM2, а также частью хромосомного островка патогенности chp/tomA (PAI).
Ряд исследований показал, что штаммы, у которых отсутствует chp/tomA PAI, демонстрируют сниженную колонизацию томатов и не вызывают симптомов заболевания. Штаммы, в которых отсутствуют обе плазмиды (pCM1 и pCM2), колонизируют растения, не вызывая признаков увядания, и поэтому считаются невирулентными. При отсутствии одной из плазмид симптомы рака томатов сглаживаются, но титры бактерий могут быть разными.
Гены, ответственные за вирулентность, кодируют томатиназу, ряд протеаз и другие ферменты, разрушающие клеточную стенку растений.
ФЕРМЕНТЫ
Томатиназа входит в число 13 белков, которые являются общими для всех штаммов Cmm, патогенных для томатов. Томатиназа разлагает томатный алкалоид а-томатин, который участвует в защите растений-хозяев от микробных агентов. Томатиназа необходима для заражения растения, хотя она существенно не влияет на степень проявления признаков болезни.
Сериновые протеазы – эти разрушающие ферменты могут способствовать бактериальной колонизации посредством деградации и изменения физиологии клетки-хозяина, чтобы в конечном счете получать питательные вещества и манипулировать защитными реакциями растения. Протеазы участвуют в различных взаимодействиях «растение – микроб» и представлены тремя группами.
Семья Pat-1. У системно инфицированных растений и во время внекорневой инфекции обнаруживается различное включение генов, ответственных за производство протеаз данного семейства, что влияет на степень проявления симптомов заболевания. Они меняют биохимические процессы в клетках растений: повышают уровни оксидазы 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты (ACO1) и связанного с патогенезом белка 4 (PR4).
ACO1 – это фермент, участвующий в биосинтезе этилена, растительного гормона, играющего важную роль в развитии и защите, уровень которого обычно повышается у растений, инфицированных Cmm. Растения томатов, нечувствительные к этилену или с дефицитом в его производстве, сильнее увядают при заражении Cmm. Это позволяет предположить, что этилен играет определенную роль в защите от Cmm и что протеазы Pat-1 участвуют в подавлении этой защиты у томатов.
Также они устраняют выраженную гиперчувствительную реакцию (ГЧ) у растений, не являющихся хозяевами. ГЧ – это вызываемая растением гибель клеток, окружающих инфекцию, которая может предотвратить распространение микробных патогенов.
Семья Ppa. Эти протеазы могут приводить к снижению выраженности симптомов у инфицированных растений.
Субтилазные протеазы обнаруживаются при внекорневых и при системных инфекциях.
Ферменты, разрушающие клеточную стенку
В дополнение к протеазам Cmm способен секретировать гидролитические углеводно-активные ферменты (казимы), которые участвуют в метаболизме и деградации компонентов клеточной стенки растений, включая полисахариды, олигосахариды и гликоконъюгаты. К ним относятся целлюлазы, ксиланазы и пектатлиазы, которые участвуют в расщеплении компонентов клеточной стенки растений – целлюлозы, ксилана и пектина соответственно, для облегчения проникновения бактерий и усвоения питательных веществ.
Подвид michiganensis обладает большим количеством казимов, чем другие патогенные подвиды C.michiganensis и грамположительные, ограниченные ксилемой бактериальные фитопатогены. Эндофитные штаммы Clavibacter в томатах содержат меньше общих казимов по сравнению с патогенными Cmm.
Целлюлазы. Во всех штаммах Cmm, патогенных для томатов, в составе целлюлаз обнаруживается белок CelA, который связывает целлюлозу и при этом участвует в неферментативном разрыхлении клеточной стенки растения путем удаления водородных связей между углеводными полимерами, что улучшает доступ к целлюлозе для гидролиза. Также в деградации целлюлозы участвуют две эндоглюканазы, которые входят в число 13 белков, присутствующих во всех томатопатогенных штаммах Cmm.
Ксиланазы обнаруживаются на низких уровнях у системно инфицированных растений.
Пектиназы. Cmm производит полигалактуроназу, которая деполимеризует пектин, и две пектатлиазы, которые воздействуют на пектат, продукт разложения пектина в растениях.
Другие белки
Другие белки, которые играют роль в патогенезе, включают перфорин и сортазу. Мутация генов перфорина или сортазы приводит к значительно более низкой частоте симптомов при внекорневой инфекции.
РЕАКЦИЯ ТОМАТА НА ИНФЕКЦИЮ
Во время заражения Cmm у томатов активируются механизмы производства и обезвреживания свободных радикалов кислорода, усиливается обмен белков и синтез гормонов (включая этилен). Для борьбы с инфекцией растения-хозяева активируют свои основные защитные реакции с помощью белков, которые обладают антимикробными свойствами и участвуют в клеточной активности, такой как передача защитных сигналов, гидролиз клеточной стенки, выработка активных форм кислорода, контактная токсичность и подщелачивание среды.
В стеблях, зараженных Cmm, отмечается угнетение ряда белков: полипептида плазматической мембраны, треониновой или серинкиназы для передачи сигнала и четырех секретируемых пероксидаз III класса. Пероксидазы III класса вырабатываются в процессе производства лигнина, заживления ран и защиты, и их количество обычно повышается в растениях при бактериальной, грибковой или вирусной инфекции. Снижение уровня этих растительных белков в томатах, инфицированных Cmm, препятствует защитной реакции растений.
ЛИГНИН ИЗ «АДЬЮЛИНА»
Сопротивляемость томатов проникновению Cmm можно повысить с помощью обработок растений препаратом «АДЬЮЛИН», разработанным НИЦ «Инновации» (рис. 3). В его состав входит гидролизованный лигнин, который поможет восполнить недостаток собственного лигнина растений. «АДЬЮЛИН» способствует повышению механической прочности покровных тканей за счет скрепления целлюлозных волокон, что образует вторичную клеточную стенку в сосудистых растениях, обладает хорошей сорбционной способностью и помогает предотвратить вторичное развитие грибных инфекций на поврежденных тканях томата. Препарат не фитотоксичен, биоразлагаем и безопасен для энтомофагов.
Рис. 3. Препарат «АДЬЮЛИН» на основе лигнина
Производственные испытания «АДЬЮЛИНА» в условиях действующего агрокомплекса на участке томатов с поражением Cmm показали, что в опытной группе выбраковка растений в 3 раза меньше, чем в контрольной. Эксперимент длился с начала марта по середину июля 2023 года с еженедельными обработками растений.
КОНТРОЛЬ Cmm
Поскольку распространение Cmm происходит при использовании зараженных семян и инфицированной рассады, а также через зараженную почву, оборудование и инструменты, чрезвычайно важно соблюдать правила агротехники. Снижение стресса растений за счет поддержания оптимальной численности, питания, плодородия и борьба с сорняками также снизят вероятность заболевания томатов (рис. 4).
Рис. 4. Стратегии борьбы с бактериальным поражением томатов
Диагностика
Ранняя диагностика болезни с применением быстрого, чувствительного и экономичного метода обнаружения Cmm имеет решающее значение для успешной борьбы с инфекцией. Особенно важно проверять семена перед посевом. Но не каждый метод диагностики подходит для тестирования этого вида материала.
С этим легко могут помочь в лаборатории НИЦ «Инновации», где исследование на наличие Cmm проводится методом ПЦР. Это позволяет обнаружить возбудителя бактериального рака в листьях, стеблях, семенах, даже в субстрате. При этом чувствительность реакции дает возможность выявить Cmm в период, когда его титры ниже тех, что вызывают симптомы, а также при скрытом течении инфекции.
Стоит помнить, что симптомы увядания могут вызываться рядом других патогенов, например Fusarium oxysporum, который является грибом, а не бактерией. Поэтому лабораторные исследования помогут точно определить характер возбудителя болезни, от которого будут зависеть стратегии борьбы. На томатах часто диагностируются сочетанные инфекции Cmm + Fusarium oxysporum, сопровождающиеся усилением увядания, появлением ярких хлорозов на листьях, которые потом некротизируются (рис. 5).
Рис. 5. Смешанная инфекция Cmm + Fusarium oxysporum: А – сильные хлорозы на листьях; Б – некротизирование хлоротичных тканей листа
Химический контроль Cmm
Для борьбы с Cmm было изучено несколько способов химической обработки семян, растений и почвы. Наиболее популярными из них являются соединения меди: гидроксид меди и сульфат меди, а также бактерициды, такие как стрептомицин, манкоцеб и их комбинации. Хотя эти антимикробные соединения приводят к эффективному снижению титров бактерий, в конечном счете их недостаточно для защиты растений, а некоторые из них фитотоксичны или способствуют развитию резистентности. Обработка семян подкисленным нитритом или 1%-й соляной кислотой и обработка почвы формальдегидом снижают как титр бактерий, так и развитие симптомов, но лишь частично эффективны против Cmm.
Исследование с использованием горячей воды для обеззараживания семян показало, что температуры 48 и 52°С были эффективны для некоторых сортов томатов, в то время как более высокие значения (56 и 60°С) отрицательно сказывались на всхожести и жизнеспособности семян. Следовательно, применение этого экологически чистого подхода потребует определения оптимальной температуры и времени для каждого конкретного сорта.
Широко изучаются различные противомикробные препараты для применения против Cmm. Например, гексапептид KCM21 проявляет сильную бактерицидную активность в отношении Cmm, разрушая бактериальные клетки. Также были обнаружены двенадцать мощных низкомолекулярных ингибиторов Cmm, которые представляют собой различные пиперидины, бензимидазолы, фенолы, феноксизопропаноламины и пирролидоны. Однако применение сельскохозяйственных химикатов или антибиотиков сталкивается с проблемами появления устойчивых патогенов, негативным влиянием на экологию и нормативными ограничениями. Поэтому тщательная характеристика этих соединений имеет решающее значение для их широкомасштабного применения.
Органические вещества растительного происхождения, такие как экстракты и эфирные масла, также обладают потенциалом для борьбы с Cmm. Фрагарин, очищенный из растворимой фракции листьев земляники, быстро подавляет рост C.michiganensis ssp. sepedonicus (кольцевая гниль картофеля) за счет рассеивания мембранного потенциала. Эфирные масла тимьяна, орегано, диктамнуса и майорана способны подавлять рост Cmm на чашках Петри. Родственник орегано, Origanum onites L., содержит эфирное масло, экстракты и чистые метаболиты (такие как карвакрол), которые проявляют мощную антибактериальную активность в отношении Cmm и существенно уменьшают развитие симптомов, не влияя на прорастание семян или рост рассады томатов.
Добавление куриного помета или навоза крупного рогатого скота к перегною, содержащему остатки томатов или перцев, весьма эффективно подавляет Cmm. А обработка лизоцимом, антимикробным ферментом, вырабатываемым животными, значительно снижает частоту бактериального рака на тепличных томатах.
Химические вещества могут быть использованы для усиления собственной защиты растений от Cmm. Например, предварительная обработка рассады томатов ацибензол-S-метилом (ASM) или DL-β-аминомасляной кислотой (BABA) значительно снижает рост Cmm и подавляет развитие симптомов. Это связано с повышением активности пероксидазы, хитиназы и фенилаланин-аммиаклиазы у растения-хозяина.
Биологический контроль
Антагонистической активностью по отношению к Cmm при обработке семян и корней в условиях теплицы обладают флуоресцентные псевдомонады. Обработка семян как штаммами Pseudomonas, так и Bacillus улучшала их качество и значительно снижала частоту бактериальных поражений в полевых исследованиях. Псевдомонады могут продуцировать различные антимикробные метаболиты, такие как феназины, пирролнитрин и цианистый водород (HCN), вместе с различными ферментами-разрушителями для подавления заболевания.
Ингибирующей активностью в условиях теплицы против Cmm обладают штаммы Streptomyces sp. HL-12, Bacillus subtilis, Trichoderma harzianum и Rhodosporidium diobovatum.
Биологический контроль на основе фагов изучается как многообещающая альтернатива из-за его специфичности, простоты приготовления и недорогого производства. Бактериофаг CMP1, первоначально выделенный из инфицированных Cmm перезимовавших стеблей томатов, специфически инфицирует Cmm. Его геном кодирует эндолизин с пептидазной активностью, который специфически лизирует Cmm, но не любые другие бактерии. Были попытки искусственно произвести эндолизин в растениях томатов с помощью генной инженерии, что придало им полную устойчивость к Cmm.
УСТОЙЧИВЫЕ СОРТА
Ни один коммерческий сорт томатов на данный момент не обладает полной устойчивостью. Исследования механизмов, снижающих патогенность эндофитных штаммов Cmm у не-хозяев, могут помочь в выведении устойчивых к Cmm сортов либо с помощью традиционной селекции, либо генной инженерии.
Бактериальный рак томатов – это не приговор. Если вы столкнулись с увяданием растений, обратитесь в лабораторию НИЦ «Инновации». Исследования точно установят возбудителя. Сотрудники компании помогут составить схему защиты растений, которая будет учитывать специфику локализации и развития патогена, при этом встроится в технологические схемы вашего предприятия. Воспользовавшись услугой «Агроконсалтинг», можно понять, какие недостатки технологии привели к распространению инфекции на комбинате и что можно предпринять для ее купирования и предотвращения вспышек в будущем. Для клиентов НИЦ «Инновации» эта услуга бесплатная. Можно научиться жить с бактериальным раком, а можно его победить. И сделать это выгодно.
