Валерия Рябинина, Наталья Блажко, Кирилл Плотников, Сергей Пашковский (ООО НИЦ «Инновации»)

В статье приведены результаты научной работы по изучению накопления и распределения вирионов вируса зеленой крапчатой мозаики огурца в растениях. Описан лабораторный опыт по искусственному инфицированию сеянцев огурца ВЗКМО в разной концентрации. Отмечено, на каком этапе вирусная нагрузка соотносится с началом видимых признаков инфекции и дальнейшим нарастанием симптомов заболевания. А также представлены данные о распределении вируса по ярусам в растениях огурца с выраженными признаками болезни, выращиваемых в тепличных условиях. 

КРАТКИЙ ОБЗОР 

Вирусные болезни являются серьезной проблемой для культивирования огурцов на предприятиях защищенного грунта. Заражение единичных растений в условиях скученности посевов, недостаточной дезинфекции инвентаря и отсутствия своевременной диагностики в короткие сроки может принять характер эпифитотии. Малое количество информации о локализации различных вирусов в растительном организме ведет к тому, что противовирусные мероприятия не учитывают специфики конкретной инфекции, а технологические приемы культивирования усугубляют распространение вируса. 

Вирус зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО, CGMMV) является наиболее распространенным патогеном, характерным для защищенного грунта. В 2022 году он подтвержден в 56% случаев в фитоматериале, присланном на исследование в НИЦ «Инновации», с подозрением на данное заболевание. Это РНК-содержащий вирус, поражающий растения семейства тыквенных. Несмотря на большое количество устойчивых гибридов, регистрируется повсеместно.

Данный вирус относят к семейству Virgaviridae, роду Tobamovirus. Вирионы имеют форму вытянутого стержня 300×8 нм с винтовой структурой капсида (рис. 1).

Рис. 1. Вирионы ВЗКМО при электронной микроскопии. Масштаб – 200 нм

Синтез вируса происходит в цитоплазме клеток с образованием характерных включений в виде гексагональных кристаллов, видимых в световой микроскоп (рис. 2А, 2В). После обработки разбавленным HCl в клетках огурца возникает большое количество веретенообразных кристаллов (рис. 2С). Эта реакция, обнаруженная Вовком (1948), очень специфична и может быть использована для быстрого выявления ВЗКМО.   

Рис. 2. Включения ВЗКМО в эпидермальных клетках огурца (А, В); паракристаллы веретенообразной формы после обработки 0,1 Н HCl (С). Масштаб – 10 мкм

Возбудитель чрезвычайно устойчив к экстремальным факторам внешней среды: вирион остается жизнеспособным при высушивании, замораживании и нагревании до 90°С. До года может сохраняться в сухих листьях, на инвентаре, поверхности культивационных сооружений и одежде рабочих.

Вирус может передаваться с семенным материалом. А так как он весьма стоек, его нельзя инактивировать нагреванием семян без повреждения зародыша. При посеве зараженных семян первые симптомы болезни появляются обычно через две недели, а спустя 40 дней заболевание принимает характер эпифитотии. Если источником первичного заражения являются растительные остатки и почва, то первые симптомы проявляются позже: на 20–30 день.

Инфицирование растений вирусом обычно приводит к системной инфекции, при которой у растения-хозяина проявляются симптомы заболевания: мозаичность, вздутие и деформация листьев, задержка роста (рис.  3). Плоды обычно не подвергаются изменениям, однако некоторые штаммы способны вызывать сильную пятнистость и деформацию плодов, их количество снижается, они становятся укороченными, крапчатыми, с горьковатым вкусом и недоразвитыми семенами. В отдельных случаях имеет место латентная инфекция, когда при определенных условиях симптомы заболевания не проявляются.

Рис. 3. Симптомы ВЗКМО на огурцах

Использование молекулярных методов исследования, например ПЦР-анализа, позволяет обнаружить наличие вируса в растении даже при скрытом течении болезни. Из-за недоступности своевременной лабораторной диагностики на местах основным способом регистрации вирусной инфекции в тепличных комплексах является визуальный учет признаков заболевания. Такой подход позволяет предпринимать меры, которые не всегда бывают успешны из-за высокой концентрации циркулирующего патогена.

Главным показателем развития вирусной инфекции является вирусная нагрузка, которая характеризуется количеством вирусных частиц в единице объема исследуемого материала. При наблюдении за развитием вирусной нагрузки с самого начала инфицирования растения можно выявить, до какого момента идет скрытое накопление вируса и с какого количества вирионов признаки инфекции становятся заметны.

В ряде работ по изучению распределения вирусных частиц в растениях огурца, инфицированных ВЗКМО, отмечается, что при системных инфекциях вирус транспортируется через сосудистую систему от первоначально зараженного листа к корням, а затем в область, близкую к вершине. Вирус не проникает в апикальную меристему, но остается локализованным  непосредственно под ней, откуда он проходит в развивающиеся зачатки листьев, что может объяснять высокую концентрацию вирусных частиц в апикальных листьях. Далее ВЗКМО, транспорт которого осуществляется по флоэме, с течением времени перераспределяется из органов верхнего яруса в нижележащие листья. Таким образом, на стадии выраженных признаков болезни преобладание числа вирусных частиц должно отмечаться в среднем и нижнем ярусах. 

Цель данного исследования заключалась в том, чтобы выявить динамику накопления вируса в клетках растения и соотнести ее со временем, когда становятся видны симптомы заболевания. А также измерить концентрацию ВЗКМО по ярусам в визуально больных растениях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Данный эксперимент включал в себя лабораторный опыт по изучению накопления вирусной нагрузки и исследование по распределению вируса в растениях, выращиваемых в условиях тепличного хозяйства. 

Лабораторный опыт. Модельным растением выбран популярный гибрид огурца Мева F1. Растения в фазе четырех настоящих листьев разделили на пять групп и искусственно инфицировали ВЗКМО в разной концентрации. Раствор для заражения готовили методом последовательных разведений, начиная с 10⁶ до 10²  копий вируса в 100 мкл. Инокуляцию проводили опрыскиванием со 100% покрытием листовых пластин. Растения контрольной группы не инфицировали. Для предотвращения переноса инфекции между группами их располагали в изолированном пространстве. Количество вируса определяли в верхушечных листьях с интервалом в неделю.

Визуальную оценку проводили, фиксируя количество больных и здоровых растений и составляя скрининговые карты. Степень поражения мозаикой оценивали по пятибалльной шкале, предложенной В. И. Кошниковичем (2005): 0 или 1 – растения внешне здоровы; 2 – слабая мозаика верхушечных листьев; 3 – отчетливая мозаика верхушечных листьев, признаки на листьях среднего и нижнего ярусов отсутствуют, задержка роста незначительная; 4 – яркие признаки мозаики на листьях и венчиках цветков, общее пожелтение растения, задержка роста, опадение завязей.

Тепличный опыт. Эксперимент проводили на гибридах огурца Ермак F1, Нева F1, Ленара F1, Миомара F1 в период естественной вспышки ВЗКМО в тепличном хозяйстве. Для исследования использовали листья верхнего, среднего и нижнего ярусов от растений с выраженными признаками вирусной инфекции. Визуально оценивали симптомы по каждому изучаемому растению в нижнем, среднем и верхнем ярусах по трехбалльной системе (0 – отсутствие признаков инфекции; 1 – слабое проявление; 2 – сильное проявление).

Для подтверждения инфицирования и дальнейшего определения вирусной нагрузки (копий вируса/100мкл) использовали метод количественной ПЦР. Из тканей листа выделяли геномную РНК вируса с последующим этапом обратной транскрипции и постановкой полимеразной цепной реакции с применением авторской тест-системы GreenExpert^®. 

Статистическую обработку данных производили общепринятыми методами с помощью программ Excel и Statistica 10. Для анализа использовали данные по всей генеральной совокупности растений эксперимента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 

Лабораторный опыт. Перед началом исследования все группы растений были проверены на наличие ВЗКМО методом количественной ПЦР. В растениях контрольной и опытных групп были обнаружены единичные вирионы. Интересен факт, что независимо от концентрации вируса, которым заражали растения, окончательное количество вирусных частиц по группам было примерно одинаковым и составило 10¹⁵–10¹⁶ (рис. 4). 

Рис. 4. Количество вирусных частиц на начало и конец эксперимента по группам инфицированных растений

При этом наблюдалось единообразие тенденции развития вирусной инфекции в каждой из групп: в течение пяти недель она перешла в экспоненциальную стадию (рис. 5). 

Рис. 5. Тенденция накопления вирусной нагрузки в течение пяти недель после инфицирования (10^n копий/100 мкл) 

     – бессимптомный период, – деформация листьев, – появление пятен и мозаичности

Накопление вирусной нагрузки в растениях зависит не от изначального числа вирусных частиц, которыми было инфицировано растение, что доказывает низкий коэффициент корреляции (r = 0,289), а от периода времени, прошедшего с момента инфицирования. Такие факторы, как условия произрастания и сортовая принадлежность, способны оказывать влияние на проявление симптомов вирусного заболевания, но экспоненциальная тенденция накопления вирусной нагрузки сохранится. 

До искусственного инфицирования растения были хорошо развиты, имели здоровую корневую систему, без признаков нарушений.

На 2-й неделе эксперимента начали проявляться первые симптомы болезни. Они характеризовались заостренными краями листьев верхушки, при отрастании листовая поверхность становилась морщинистой, края загибались внутрь. На 4-й неделе к перечисленным выше симптомам добавились слабовыраженные, неорганизованные светло-зеленые пятна на листовой пластине, которые к концу опыта сформировали четкую мозаичность (рис. 6).

Рис. 6. Признаки ВЗКМО на огурцах при искусственном инфицировании: А – 2-я неделя эксперимента; В – 3-я неделя; С – 4-я неделя

В ходе опыта было установлено, что различные симптомы проявляются на разных отрезках кривой накопления вирусной нагрузки. Мозаичность в большей степени привязана к экспоненциальному отрезку графика, а деформация листовой пластины – к линейному (рис. 5).

У некоторых растений наблюдалась существенная задержка роста. При этом зависимости среднесуточного прироста от количества вируса в растении и концентрации вируса при заражении не выявлено.

Тепличный опыт. При проведении визуального обследования на растениях отмечались следующие признаки ВЗКМО: очаги некроза (82,90%), морщинистый лист (100%), удлиненные края листа (97,43%), редуцированные листья (94,87%), задержка роста растения (80,34%). Степень проявления данных признаков оценивалась в основном в 1 балл (рис. 7).

Рис. 7. Распространенность признаков ВЗКМО на растениях огурца

Результаты количественной ПЦР показали, что независимо от сорта вирусные частицы ВЗКМО накапливаются главным образом в среднем (46%) и нижнем (36%) ярусах. Данные подтверждает коэффициент корреляции, равный 0,99. Распределение вирусных частиц представлено графиком (рис. 8). 

Рис. 8. Типы распределения вирусной нагрузки по ярусам

Полученные результаты подтверждают установленные другими исследователями закономерности, которые касаются движения тобамовирусов в растениях. Раннее обнаружение большого числа вирионов в листьях верхнего яруса связано с более быстрым транспортом вирусных частиц по внутренней флоэме. А позднее накопление их в среднем и нижнем ярусах вызвано медленным перемещением по внешней флоэме. Это и объясняет преобладание вирусных частиц в среднем ярусе на момент проявления признаков ВЗКМО.

Вирусная нагрузка в изученных растениях колебалась от 2,8×10⁴ до 78,7×10⁹ копий вируса/100мкл. Коэффициент вариации (С_v = 63,77%) указывает на высокую изменчивость вирусной нагрузки от растения к растению, которая зависит от индивидуальной восприимчивости организма, при условии постоянства факторов окружающей среды, таких как температура, влажность и освещенность. 

ВЫВОДЫ

В ходе проведенных лабораторных исследований было установлено: 

1. Начальная концентрация вируса на момент инфицирования растений практически не коррелирует (r = 0,289) с динамикой вирусной нагрузки. 
2. Накопление вирусной нагрузки подчиняется экспоненциальному уравнению и зависит от продолжительности временного периода после инокуляции.
3. В условиях лабораторного опыта установлено, что ярко выраженная мозаичность формируется на экспоненциальном отрезке кривой накопления вирусной нагрузки, а загнутые края и сморщивание листьев – на начальных этапах развития инфекции. При этом зависимости скорости роста растений от величины вирусной нагрузки не обнаружено.
4. Высокие значения вирусной нагрузки в растениях огурца в подавляющем большинстве случаев отмечаются в среднем (46%) и нижнем (36%) ярусах. Установлена зависимость вирусной нагрузки от яруса растения (r = 0,99).
5. Высокая изменчивость вирусной нагрузки, при условии постоянства внешних факторов, предположительно связана с силой защитных реакций каждого растения в отдельности.

В производственном цикле при отсутствии профилактических мероприятий вирусная нагрузка в растениях будет развиваться по прямой с резким переходом в экспоненциальную стадию. Внедрение ПЦР в практику ранней диагностики вирусных инфекций в тепличных комплексах позволит прогнозировать вспышки инфекции и вовремя принимать адекватные меры для профилактики или купирования инфекционного процесса. Организация лабораторий на местах даст возможность оптимизировать расходы на обработки и сократить убытки от недополученной и несортовой продукции.