Валерия Рябинина, координатор направления лабораторной диагностики НИЦ «Инновации»

В этой статье мы будем разбираться, нужна ли лабораторная диагностика вирусных инфекций растений. Если нужна, то какая. И что требуется для того, чтобы быть уверенным в полученном результате.

Вирус… Когда об этом начинаешь думать, дыхание непроизвольно слегка задерживается. И какая-то часть мозга очень не хочет, чтобы это оказалось правдой. Но уже все перепробовано: и подкормки оптимизированы, и фунгицидами пролили. Больных растений с каждым днем становится больше. Да, нужно отправлять их в лабораторию. Но ведь тогда об этом узнают посторонние. Лишь бы не карантин! И сердце тоже начинает биться немного реже. 

Думаю, эти чувства знакомы многим агрономам. Особенно когда сталкиваешься с подобной ситуацией впервые. Я приглашаю разобраться, в чем именно заключается диагностика вирусных инфекций, какие методы для этого применяют и какие слабые места есть у каждого из них. Поделюсь интересными фактами из опыта определения фитопатогенов в растительном материале. А также расскажу, чем научно-исследовательский центр «Инновации» может помочь агрономам тепличных комбинатов в решении проблемы диагностики вирусных инфекций.

Попадая внутрь растительного организма, вирусы вызывают изменения в физиологии и биохимии клеток, что сказывается на внешнем виде всего растения или его частей. Проявления зависят от многих факторов: вида культуры, вирулентности и агрессивности вируса, стадии развития инфекции, условий окружающей среды. 

Различают четыре основных типа симптомов вирусных заболеваний (рис. 1):

1. Угнетение роста наблюдается при большинстве вирусных инфекций, может выражаться в общей задержке роста растения, в укорачивании междоузлий, в замедлении роста главных побегов при одновременном усиленном образовании боковых. 

2. Изменение окраски – наиболее распространенный симптом вирусных болезней. Проявляется в виде: а) мозаики – имеет вид пятен и узоров (кольца, полукольца, извилистые рисунки) на листьях; б) хлороза – диффузного пожелтения листьев; в) антоцианоза – окрашивания листьев, краев их жилок, стеблей в фиолетовые оттенки.

3. Деформация органов – изменение формы листьев, цветков, плодов происходит из-за неравномерного роста отдельных участков тканей. Изредка отмечаются опухоли и наросты.

4. Некрозы – обычно серого, бурого, черно-коричневого цвета, округлой и вытянутой формы, иногда с окаймлением. 

Как видите, диагностические признаки вирозов разнообразны и позволяют произвести только предварительную ориентировку в их этиологии. Многие абиотические факторы, такие как нарушения питания, микроклимата, освещенности и т.д., могут вызывать проявления, очень похожие на вирусные (рис. 2). Поэтому в первую очередь стоит проанализировать неинфекционные причины, провести корректирующие мероприятия. Если после всех принятых мер состояние растений не улучшилось – стоит задуматься о направлении фитоматериала в лабораторию.

Рис. 1. Симптомы вирусных инфекций: фото томатов – задержка роста, нитевидность листьев, хлороз и некроз листовых пластин при вирусе обычной мозаики (ВОМ); фото огурца – мозаичные проявления и деформация листьев при вирусе зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО)

Для диагностики вирусных инфекций используют иммунохроматографический анализ (ИХА), иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразную цепную реакцию (ПЦР). 

Методы иммуноанализа – ИХА и ИФА – основаны на взаимодействии антител с антигеном (вирусом) и регистрации формирующихся иммунных комплексов. Формирование комплекса антиген-антитело и определяет слабое место данных методов: их чувствительность зависит от концентрации, активности и специфичности используемых антител. Различные виды антител обладают различной эффективностью связывания антигена. В случае если выбранные антитела образуют неустойчивый комплекс антиген-антитело, это приводит к удалению антигена из системы и ложноотрицательному результату.

Метод полимеразной цепной реакции применяют для обнаружения генетического материала фитопатогенов с использованием специфических нуклеотидных последовательностей (праймеров). Вирусные геномы высокоизменчивы. Это определяет большое количество штаммов и мутаций среди вирусов одного вида.   Поэтому для успешной ПЦР необходимо выбирать консервативные участки генов. В связи с этим сделать тест-систему, которая бы «ловила» абсолютно все штаммы, затруднительно. Это требует от специалистов высокой квалификации и огромного опыта.

Рис. 2. Изменения, вызванные абиотическими факторами: фото томата – нарушение окраски плода при недостатке солнечной радиации; фото огурца – краевые хлорозы при недостатке азота, волнистость листовой пластины и некрозы, вызванные «капелью»

Каждый из этих методов хорош для решения определенных задач. ИХА на тест-полосках удобно использовать как экспресс-диагностику прямо в теплице. Это недорогой, быстрый и простой в интерпретации результатов метод, не требующий специального оборудования и подготовки оператора. При этом стоит учитывать его высокий предел обнаружения и малую информативность. 

Иммуноферментный анализ пригоден для массового исследования в лаборатории, однако для его реализации необходимы специальные приборы и квалифицированный персонал. Для анализа требуется небольшое количество клеточного сока листовой ткани или проростков. Он позволяет обнаружить меньшие концентрации вирусов в образце по сравнению с ИХА. Появляется возможность проводить количественные измерения. В одном образце можно обнаружить только один патоген.

Гораздо больше перспектив в обнаружении и изучении вирусов открывает полимеразная цепная реакция. Этот метод обладает самым низким пределом обнаружения патогенов. Он позволяет выявлять несколько вариантов вируса в одной пробе (рис. 3). Количественные измерения дают возможность определять вирусную нагрузку в растении. Таким образом, проводя мониторинговые исследования, можно прогнозировать развитие вирусной инфекции на комбинате и своевременно корректировать систему защиты растений.

Рис. 3. Определение нескольких генотипов вируса мозаики пепино в одной пробе методом ПЦР

Очевидно, что эффективность борьбы с инфекциями многократно выше на начальных стадиях их развития. Поэтому окончательный и наиболее точный диагноз должен ставиться на молекулярном уровне. Наши исследования по изучению накопления вирусной нагрузки в растении огурца на примере ВЗКМО выявили, что вирус активно накапливается в растении, когда видимые признаки отсутствуют. Опыт показал, что если начать противовирусные обработки с момента обнаружения вирусов методом ПЦР, это позволит сохранить продуктивность растений без увеличения выхода нестандартной продукции. 

Много семенного материала завозится в Россию из-за границы. Это один из путей, приводящих к появлению вирусных инфекций, которые ранее не встречались. Примером такой инфекции может служить вирус коричневой морщинистости плодов томата (ToBRFV). В 2020 году об этом заболевании стали появляться первые «кулуарные» сообщения. Еще в прошлом году агрономам в тепличных комбинатах затруднительно было определить эту инфекцию по видимым признакам. В лабораторию НИЦ «Инновации» поступали заявки по определению коричневой морщинистости в образцах с нетипичными симптомами для вирусных инфекций, встречаемых ранее. При этом вирус был подтвержден всего в 20% случаев. В настоящее время данная инфекция добралась уже до Сибири. 

Научно-исследовательский центр «Инновации» использует в своей работе метод ПЦР для определения фитопатогенов в растениях, семенном материале, дренажных водах, смывах с оборудования теплиц. Чаще всего образцы направляют в лабораторию для определения уже проявившейся инфекции. Стоит отметить, что агрономы начинают задумываться о чистоте покупаемых семян. За последний год выросло количество обращений на определение вирусов в посевном материале.

Фото 1. Выделение нуклеиновых кислот из образцов фитоматериала (на фото – инженер-биотехнолог НИЦ «Инновации» Сергей Пашковский)

В образцах от растений, присланных в лабораторию НИЦ «Инновации», были обнаружены следующие фитопатогены (рис. 4): в огурцах – ВЗКМО (56% случаев), ВОМ (18%), одновременное заражение этими вирусами диагностировали в 26% случаев; на томатах чаще всего встречался ВОМ (32,5%) и вирус томатной мозаики (29,4%), вирус коричневой морщинистости плодов томата определился в 17,6% случаев, по 8,8 % – вирус мозаики пепино и вирус желтой курчавости листьев томата, 2,6% – случаи смешанных инфекций.

Рис. 4. Частота обнаружения вирусов в фитоматериале (по данным НИЦ «Инновации»)

Особенно интересен случай одновременного заражения растений томата вирусом мозаики пепино и ВОМ (рис. 5 и 6). Оба этих патогена обладают весьма изменчивым геномом, поэтому их диагностика бывает затруднительна. На пораженных растениях отмечались нитевидность листьев, антоцианоз, бугорчатость листовой пластины, плоды неравномерно окрашены, мягкие на ощупь. Количественный ПЦР-анализ показал значительное преобладание вируса ВОМ по сравнению с вирусом мозаики пепино. 

В литературных источниках не встречается информация об изучении данной коинфекции. Возможно, патогены находятся в растении в состоянии нейтрализма. И степень проявления одного или другого вируса зависит от факторов окружающей среды. Описаны молекулярные механизмы взаимодействия ВОМ и Роtexvirus, к коим относится мозаика пепино, на примере вируса картофеля Х. В данном случае можно говорить о комменсализме патогенов, так как Роtexvirus за счет белков TGBp1 и CP опосредует ускорение размножения ВОМ благодаря блокированию одного из способов защиты растений, который подавляет репликацию вирусной РНК. Значительное количество ВОМ в образце подтверждает эту гипотезу.

Рис. 5. Признаки сочетанной инфекции ВОМ и мозаики пепино на листьях томата

Рис. 6. Признаки сочетанной инфекции ВОМ и мозаики пепино на плодах томата

Впервые вирус мозаики пепино зарегистрирован на территории России в 2013 году. С того момента он начал движение по тепличным комбинатам. Исследования, проведенные в лаборатории НИЦ «Инновации», показали, что на территории нашей страны встречаются 2 генотипа пепино: американский (US2) и чилийский. Изучение штаммов и генотипов дает науке информацию о происхождении вирусов, их сходстве и различиях. Установлено, что данные генотипы являются наиболее агрессивными.

Изначально считалось, что мозаика пепино передается исключительно вместе с инфицированными семенами томатов. Но исследования показали, что данный возбудитель не находится в эмбрионе семени, а сохраняется на его оболочке и потому может беспрепятственно заражать растения при непосредственном контакте. Определение вируса пепино в семенах, проводимое в лаборатории НИЦ «Инновации», показало, что вирус действительно обнаруживается на их оболочке. При этом после обработки семян нуклеазами вирус отсутствовал. Из полученных данных можно сделать вывод, что замачивание семенного материала перед посевом в растворе «Энзим-ФИТО» может снизить риск заноса инфекции на комбинат.

Вообще лабораторная диагностика мозаики пепино является отдельной болью агрономов. Эта инфекция включена в Единый перечень карантинных объектов ЕАЭС. И немногие предприятия решаются направлять образцы для исследования на карантинные болезни. Один из способов, который может помочь решить эту проблему, – организация ПЦР-лаборатории на комбинатах. НИЦ «Инновации» предлагает услугу по организации лаборатории «под ключ». У специалистов научно-исследовательского центра имеется большой опыт по организации ПЦР-лабораторий, три из которых успешно лицензированы для работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности. 

Наличие своей лаборатории позволит контролировать качество закупаемого посадочного материала, проводить мониторинговые исследования на фоновые инфекции на всех этапах возделывания культуры и своевременно применять меры по защите растений. Отпадет необходимость посылать образцы в сторонние организации для анализа. Появится возможность проводить научную работу, что будет способствовать привлечению на комбинат заинтересованных специалистов. 

ООО НИЦ «Инновации» совместно с ООО «АгроИнвест» успешно реализован проект по организации ПЦР-лаборатории. Закуплено современное и качественное оборудование. На протяжении 10 дней на комбинате шла работа по оборудованию рабочих мест и обучению сотрудников. Сегодня лаборатория ежедневно проводит мониторинговые исследования в соответствии с планом, составленным на комбинате. 

Фото 2. Организация ПЦР-лаборатории в ООО «АгроИнвест». Рабочие моменты

При направлении образцов в лабораторию необходимо придерживаться строгих правил отбора проб. Их несоблюдение может привести к ошибкам исследования. Основная причина ложноположительных результатов – перекрестное загрязнение образца патогеном извне. Это бывает, если:

1) отбор проб производится без использования отдельных перчаток для каждого образца. На руки оператора, который отбирает пробы, может попадать сок растений, содержащий патоген, в невидимом для глаза количестве, но достаточном для ПЦР. Поэтому важно менять перчатки после каждого образца;

2) внутренние поверхности тары для упаковки образцов касались поверхностей, на которых мог содержаться патоген;

3) тара для упаковки образца используется повторно. Даже если кажется, что пакет или емкость хорошо промыты, там могут оставаться незначительные количества патогена. 

Ложноотрицательные результаты бывают при попадании в образец ингибирующих агентов или при разрушении патогена в процессе транспортировки. Необходимо помнить, что:

1) хлор – сильный ингибитор ПЦР, поэтому при использовании хлорсодержащих дезсредств смывы с поверхностей можно брать для исследования не ранее 3 суток после последней промывки;

2) целлюлоза также является ингибитором ПЦР, поэтому не стоит использовать для отбора проб натуральную вату и деревянные палочки; 

3) при длительной транспортировке материал может загнивать, в нем накапливается бактериальная и грибковая микрофлора, ферменты которой подавляют вирусный патоген – объект исследования. Гнилостный материал исследованию не подлежит. Поэтому рекомендуется отправлять образцы в термоконтейнерах экспресс-доставкой. 

Хочется отдельно остановиться на правилах для отбора проб растений, так как именно их чаще всего направляют на исследование:

1) для ПЦР-исследования нет необходимости направлять в лабораторию целое растение. Достаточно отобрать с разных ярусов несколько его частей (например, листья) с ярко выраженными признаками поражения;

2) отбор частей растения для анализа следует проводить в одноразовых перчатках. Для предотвращения контаминации исследуемых образцов обязательной является смена перчаток на новые при переходе к следующему растению;

3) для упаковки образцов используют новый пакет с застежкой типа Zip Lock. Нельзя касаться внутренних поверхностей пакета. Открывать его необходимо чистыми перчатками только перед отбором проб;

4) снаружи на пакет наклеивают этикетку с номером и наименованием образца. Для защиты надписи этикетку оклеивают прозрачным скотчем (рис. 7). Надпись должна быть четкой и сохраняться в течение всего времени транспортировки пробы; 

5) в лабораторию образцы направляют вместе с заявкой. Маркировки на образце и в заявке должны полностью совпадать;

6) запрещено класть бумажный бланк заявки и этикетку внутрь пакета с образцом.

Рис. 7. Пример правильно упакованного и промаркированного образца

В завершение хочется сказать, что НИЦ «Инновации» готов предложить свой опыт и лабораторную базу для определения фитопатогенов. Конфиденциальность и качество наших исследований гарантированы каждому клиенту. Как альтернатива – поможем создать ПЦР-лабораторию с нуля. Дадим рекомендации по расположению помещения на территории комплекса. Подберем все необходимое оборудование с учетом вашего бюджета. Установим и запустим его в работу. Проведем обучение ваших специалистов основам ПЦР-диагностики. Линейка диагностических тест-систем Green Expert поможет определить часто встречающиеся болезни. На выходе вы получите полноценную лабораторию для решения многих производственных задач.